اسید سیتریک و قارچ آسپررژیلوس نایجر در تعامل با هم، باعث تولید اسید سیتریک به میزان بالایی می شوند.اسید سیتریک بزرگترین اسید آلی مصرف شده در جهان است و به عنوان واسطه در چرخه Kreb تشکیل می شود. اما در مقادیر بیشتری در قارچ آسپررژیلوس نایجر انباشته می شود، ممکن است به دلیل ناهنجاری متابولیک باشد. این جنبه از قارچ برای تولید تخمیر اسید سیتریک مورد بهره برداری قرار می گیرد. همچنین به عنوان یک محصول طبیعی در بسیاری از میوهها به ویژه میوههای مرکبات یافت می شود. قبل از توسعه فن آوری تخمیر، اسید سیتریک از آب این میوه ها استخراج می شد.اسید سیتریک همچنین می تواند از گلیسرو تولید شود، اما بسیار گران است.تولید اسید سیتریک با تخمیر سطحی در سال 1923 آغاز شد. اسید سیتریک تولید شده در سال 1929 5000 تن بود که تا سال 1992 به 4.0 تن افزایش یافته است. 60 درصد اسید سیتریک تولید شده در صنایع غذایی و آشامیدنی استفاده می شود. یک ماده طعم دهنده و نگهدارنده، در حالی که 10٪ در صنایع دارویی به شکل سیترات آهن، حدود 25٪ از اسید سیتریک در صنایع شیمیایی استفاده می شود.
فرآیندهای مختلف تخمیر مورد استفاده برای تولید اسید سیتریک به دلایل زیر، قارچ آسپررژیلوس نایجر( Aspergillus niger) در بیشتر فرایندها استفاده می شود که از کاربرد های اسید سیتریک است.
فرایند کشت سطح با استفاده از محیط کشت جامد و فرایند کشت زیر آب با استفاده از راکتور، به طور خلاصه در اینجا شرح داده می شود:
اگرچه این یک فرآیند قدیمی است، اما هنوز هم استفاده می شود. نوعی فرآیند تخمیر ثابت است.این فرایند شامل چهار مرحله است
سوسپانسیون اسپور به عنوان تلقیح برای تولید اسید سیتریک استفاده می شود. سویه مناسب و پر بازده A. niger از یک کشت سهام انتخاب می شود. كشت سهام در سطح ماده اسپور كننده موجود در بطری های شیشه ای تلقیح می شود. بطری ها به مدت 10-14 روز در دمای 25 درجه سانتیگراد انکوبه می شوند.ترکیب عناصر کمیاب مانند نمک های منگنز، روی یا آهن در محیط اسپور باید به طور مناسب حفظ شود. در غیر این صورت آنها بر عملکرد اسید سیتریک در تخمیر واقعی تأثیر می گذارند و اسید سیتریک و قارچ آسپررژیلوس نایجر بسیار مهم است. سوسپانسیون هاگ با تعلیق اسپورهای رشد یافته در رقیق کننده های مناسب مانند آب حاوی ماده مرطوب کننده، سدیم لوریل سولفات بدست می آید. علاوه بر تعداد کل، زنده ماندن محصول اسپور حیاتی است.
محیط مورد استفاده در تولید اسید سیتریک، باید دارای منبع کربوهیدرات و نمک های غیر آلی باشد. از انواع مواد می توان به عنوان منبع کربن استفاده کرد. اما به طور کلی ملاس ساکارز و چغندر به عنوان منبع کربن استفاده می شود.ساکارز بهترین منبع کربن در بین مواد آلی مختلف آزمایش شده است. گزارش شده است که محیطی با ساکارز کمتر از 15٪ عملکرد بالایی از اسید سیتریک دارد. وقتی بخشی از ساکارز توسط فروکتوز یا گلوکز جایگزین شد، کاهش عملکرد اسید سیتریک مشاهده می شود. از نظر تجاری، ملاس چغندر همچنین به عنوان منبع کربن به طور گسترده ای در تولید اسید سیتریک با استفاده از A.niger استفاده می شود.ملاس چغندر به غیر از قندها، حاوی مقادیر زیادی نمک غیر آلی است. برای از بین بردن این نمک های غیر آلی بیش از حد، قبل از استفاده در آماده سازی محیط، با فروسیانید یا فری سیانید درمان می شود. متناوباً، نمک های غیرآلی با عبور ملاس چغندر از طریق یک رزین تبادل کاتیونی حذف می شوند.عناصری مانند نیتروژن، پتاسیم، فسفر و منیزیم نیز به غیر از منبع کربن در محیط مورد نیاز است. آنها به صورت نیترات آمونیوم، پتاسیم دی هیدروژن فسفات یا پتاسیم منهیدروژن فسفات و سولفات منیزیم به حداقل در محیط اضافه می شوند.وجود این عناصر در غلظت بالاتر باعث کاهش عملکرد اسید سیتریک و افزایش عملکرد اسید اگزالیک می شود.pH محیط را باید با استفاده از اسید کلریدریک به 5/3 – 3/5 تنظیم کرد. pH پایین مطلوب ترین مورد گزارش شده است. زیرا آلودگی کمتر، تشکیل اسید سیتریک بیشتر، سرکوب تشکیل اسید اگزالیک و عقیم سازی آسان محیط را تسهیل می کند.
محیط تولید را به گونه ای در ظرف های کم عمق قرار می دهند که لایه نازکی از محیط با عمق 1 تا 2.5 سانتی متر تشکیل شود. اسپورهای تلقیح به محیط اضافه می شوند تا در سطح آن شناور باشند. این امر توسط دستگاه های تعدیل کننده مناسب حاصل می شود. جوجه کشی در اتاق های جوجه کشی در دمای 30-40 درجه سانتی گراد انجام می شود.در طی تخمیر دما در دمای 30 درجه سانتیگراد ثابت نگه داشته می شود. تهویه جریان هوا برای تبادل گاز نیز مهم است زیرا اگر CO 2 در اتمسفر به 10٪ افزایش یابد میزان تولید اسید سیتریک کاهش می یابد. در طی 24 ساعت پس از تلقیح، اسپورهای جوانه زنی لایه نازکی از میسلیوم را روی سطح محلول غذایی تشکیل می دهند. در نتیجه جذب یونهای آمونیوم، pH در مایع کشت به 1.5 تا 2.0 می رسد.بعد از 30 ساعت تخمیر، اگر غلظت آهن بیشتر اسید اگزالیک باشد و رنگدانه مایل به زرد ایجاد شود که به نوبه خود مانع روند بهبودی می شود. میسلیوم کاملاً توسعه یافته به صورت لایه سفید پیچیده ضخیم روی محیط مایع شناور است. تخمیر پس از 8-14 روز متوقف می شود.میزان تبدیل زیستی قند به اسید سیتریک به نسبت سطح به حجم محیط بستگی دارد. اگر نسبت کمتر باشد، عملکرد اسید سیتریک بیشتر خواهد بود. در این روش تشتک کم عمق، نسبت سطح به حجم محیط کمتر است، به همین دلیل سطح زیادی از حصیر میسلیوم در معرض لایه کم عمق محیط قرار می گیرد.در این شرایط قند به اسید سیتریک تبدیل می شود. به همین دلیل این فرایند را برتر از فرایند فرهنگ غوطه ور می دانند. عملکرد در هر ساعت از این فرآیند به 1.2 – 1.5 کیلوگرم مونوهیدرات اسید سیتریک در هر متر مربع از سطح تخمیر می رسد.
میسلیوم از آبغوره تخمیر جدا می شود. هر اسید سیتریک داخل سلولی موجود در میسلیوم با فشار دادن میسلیوم بدست می آید. آبگوشت فیلتر شده با هیدروکسید کلسیم تیمار می شود. فیلتر شده و شسته می شود. سپس با حجم مساوی اسید سولفوریک تحت درمان قرار می گیرد تا اسید سیتریک آزاد شود. سولفات کلسیم در این فرآیند به عنوان رسوب تشکیل می شود.رسوب توسط فیلتراسیون جدا می شود. یک محلول ناخالص اسید سیتریک بدست می آید که با تیمار با کربن فعال رنگ زدایی شده و همچنین از مینرال سازی می شود. سرانجام بلورهای خالص اسید سیتریک در اثر تبخیر تولید می شوند. همچنین به روش جایگزین با روش استخراج ضد جریان بازیابی می شود.
در این روش A. niger ساخته می شود تا به طور یکنواخت در محیط تولید مایع پخش شود. تخمیر به طور کلی در دستگاه های تخمیر بزرگ با ظرفیت 4 کیلوگرم هزار گالن انجام می شود و همراه با همزن مکانیکی و اسپارج تهیه می شود. هشتاد درصد از تولید اسید سیتریک در جهان توسط این فرآیند تولید می شود. هزینه تولید با این روش 25٪ کاهش می یابد. این شامل هزینه کار کم، دوره کمون طولانی تر، مصرف انرژی بیشتر و تکنیک های پیچیده است.سه عامل برای تولید در فرآیند فرهنگ غوطه وری مهم است. آنها کیفیت فلز مورد استفاده برای ساخت تخمیر، ساختار میسلیوم و اکسیژن رسانی هستند. کاندیدا لیپولیتیکا، قارچ آلکان با استفاده از قارچ نیز می تواند در تولید اسید سیتریک تحت تخمیر مداوم استفاده شود. این محصول 45 درصد بیشتر از تولید اسید سیتریک طبیعی است.
از حصیرهای میسیلیوم به نام گلوله به عنوان تلقیح برای تخمیر در این فرآیند استفاده می شود. سویه های مناسب و پر بازده A. niger از یک کشت سهام انتخاب می شوند. اسپورها در تخمیر کننده بذر باعث جوانه زدن می شوند. یک محلول غذایی حاوی 15٪ قند از ملاس در این تخمیر کننده بذر استفاده می شود. برای القا تشکیل گلوله های میسلیوم ، یون های سیانید به محیط اضافه می شوند.تشکیل پلت تا حد زیادی به غلظت یون های سیانید در محیط بستگی دارد. عملکرد کمتری از اسید سیتریک در صورتی اتفاق می افتد که یون های سیانید غلظت کمتری داشته باشند. این به این دلیل است که غلظت کمتری از یون های سیانید باعث تشکیل میسلیوم طبیعی به جای گلوله می شود. اسپورها در دمای 32 درجه سانتیگراد جوانه می زنند و در مدت 24 ساعت گلوله هایی با قطر 0.2 – 0.5 میلی متر تشکیل می دهند. در این دوره pH به 4.3 کاهش می یابد. این گلوله ها بعنوان تلقیح برای تخمیر کننده های تولید استفاده می شوند.تهیه ماده متوسط محیط استفاده شده برای فرایند کشت سطح نیز در این فرآیند استفاده می شود.
بیشتر تخمیرهایی که برای تولید اسید سیتریک مورد استفاده قرار می گیرند در محدوده 10 تا 220 کلت ساخته می شوند. برای جلوگیری از شسته شدن فلزات سنگین باید از فولاد ضد زنگ ساخته شوند. فولاد نرمال، اگر از آن در ساخت دستگاه های تخمیر استفاده شود، در سطح pH پایین 1-2، ممکن است از تشکیل اسید سیتریک جلوگیری کند. تخمیر کننده های کوچک با ظرفیت حداکثر 1000 لیتر حتی اگر از فولاد ضد زنگ ساخته شده اند. به دلیل نسبت سطح / حجم زیاد، باید دارای پوشش پلاستیکی باشند. با این حال، چنین پوشش پلاستیکی برای تخمیر کننده های بزرگ فولاد ضد زنگ لازم نیست.گلوله های میسلیوم تولید شده در مخزن بذر به صورت اسپتیك به تخمیر كننده منتقل می شوند و در دمای ثابت 30 درجه سانتی گراد انكوبه می شوند. ساختار میسلیوم که در تخمیر کننده تشکیل می شود برای یک فرایند موفقیت آمیز تولید حیاتی است. اگر میسلیوم شل و رشته ای و دارای شاخه های محدود و فاقد کلامیدوسپور باشد، اسید سیتریک کمی تولید می شود.اگر میسلیوم به صورت گلوله باشد اسید سیتریک بهینه ایجاد می شود. نسبت آهن به مس در محیط ، ماهیت میسلیوم را تعیین می کند. در بعضی موارد، تخمیر کننده های تولید مستقیماً با اسپور تلقیح می شوند.اگرچه A. niger به اکسیژن نسبتاً کمی نیاز دارد، اما به کمبود اکسیژن حساس است. در طول فرآیند تخمیر باید حداقل غلظت اکسیژن 20 تا 25٪ مقدار اشباع وجود داشته باشد. وقفه های کوتاه در اکسیژن رسانی تولید را به طور برگشت ناپذیر متوقف می کند. سرعت هوادهی باید 0.2-1.0 حجم در دقیقه باشد. در مرحله تولید اسید به دلیل گرانروی کم، هم زدن لازم نیست. بنابراین، اگرچه برخی از گیاهان از تخمیرهای همزن استفاده می کنند، می توان از راکتورهای انتقال هوا نیز استفاده کرد.کف کردن مشکلی در روند فرهنگ غوطه وری است. با این حال، با افزودن مواد ضد کف مانند روغن چربی در فواصل مکرر، می توان آن را کنترل کرد. یک محفظه کف، 1/3 سوم اندازه حجم تخمیر، هم در بیوراکتورهای بالابر هوا و هم همزن مورد نیاز است. از دستگاه های ضد کف کف مکانیکی نیز می توان استفاده کرد. پیشرفت فرآیند تخمیر با محاسبه محتوای قند و اسید سیتریک در تخمیر به طور منظم کنترل می شود.